Курсовая с практикой на тему Анализ геномных генов изоформ люциферазы Metridia longa.

Содержание:

Введение. 3

1. Литературный обзор. 8

2. Материалы и методы.. 11

3. Результаты и обсуждение. 14

Заключение. 27

Список использованной литературы.. 28

Приложение. 31

Введение:

Биолюминесцентные копеподы
часто являются наиболее распространенным морским зоопланктоном и играют важную
роль в океанических пищевых сетях. Копеподы Metridia проявляют особенно яркую
биолюминесценцию, и молекулярная основа их производства света только недавно
начала изучаться. Здесь мы добавим к этому числу работ транскриптомическое
профилирование Metridia lucens, распространенного вида, встречающегося в
умеренных, северных и южных широтах. В этом ранее молекулярно нехарактерном
виде мы находим типичный набор генов люциферазы паралог, найденный в Метридии.
Еще более удивительно, что мы находим заслуживающие внимания предполагаемые
последовательности люциферазы, которые не были описаны у видов Metridia, что
указывает на то, что биолюминесценция, производимая этими копеподами, может
быть более сложной, чем ранее было известно. Это включает в себя еще одну
люциферазу копепода, а также одну из креветок. Кроме того, эксперименты с
кормлением с использованием масс-спектрометрии и 13 с мечеными L-тирозином и
L-фенилаланином твердо устанавливают, что M. lucens производит свой собственный
кишечнополостный люциферин, а не получает его через диету. Этот синтез
кишечнополостных был непосредственно подтвержден только у одного вида копепод.

Биолюминесцентные белки широко
используются в качестве репортерных молекул в различных анализах in vitro и in
vivo. Самая маленькая изоформа люциферазы Metridia (MLuc7) — это
высокоактивный, естественно секретируемый фермент, который наряду с другими
изоформами люциферазы отвечает за яркую биолюминесценцию морского копепода
Metridia longa. В настоящем исследовании мы сообщаем о построении двух
вариантов гибридного белка, состоящего из одноцепочечного антитела MLuc7 и
14D5a к поверхностному гликопротеину е вируса клещевого энцефалита, в качестве
модельного партнера слияния. Мы демонстрируем, что, в то время как слияние
одноцепочечного антитела с N-или с — концом MLuc7 не влияет на его
биолюминесцентные свойства, сайт связывания на одноцепочечном антителе влияет
на его связывающую способность. Сродство гибридного белка 14D5a-MLuc7 (KD = 36,2
нм), где с-конец одноцепочечного антитела был слит с N-концом MLuc7, оказался в
2,5 раза выше, чем у обратного, MLuc7-14D5a ( K D = 87,6 нм). Предел
обнаружения гибридного белка 14D5a-MLuc7 оценивался как 45 ПГ рекомбинантного
гликопротеина E. хотя наименьшая изоформа люциферазы M. longa была
протестирована в качестве партнера слияния только с одноцепочечным антителом,
разумно предположить, что MLuc7 также может быть успешно использован в качестве
партнера для генетического слияния с другими белками.

Ярко-синяя биолюминесценция
морских копепод, возникающая в виде секреции из эпидермальных желез в ответ на
различные стимулы, также приписывается люциферазам, использующим в качестве
субстрата реакции кишечнополостные [4]. В начале 2000-х годов первые люциферазы
копепод были клонированы из видов Gaussia princeps и Metridia longa с
использованием функционального скрининга [16, 17]. Позже тот же подход был
применен для выделения трех дополнительных изоформ люциферазы M. longa [18, 19,
20]. На основании сравнения аминокислотных последовательностей изоформ Метридий
друг с другом и с таковыми у других видов копепод было высказано предположение,
что эти изоформы являются продуктами четырех групп неаллельных паралогичных
генов [20]. Все люциферазы копепод представляют собой одноцепочечные белки с
молекулярной массой 18,4-24,3 КДА. Люциферазы содержат естественный сигнальный
пептид для секреции, переменный N-конец которого составляет до одной трети
длины аминокислотной последовательности, что существенно не влияет на их светоизлучающую
функцию, а также с-концевая консервативная область, где расположен активный
центр фермента [4]. Эта консервативная область образована двумя аналогичными
повторяющимися доменами длиной около 70 аминокислотных остатков, которые, в
свою очередь, включают 32 высоко консервативные аминокислотные
последовательности, каждая из которых содержит пять консервативных остатков Cys
[17]. Присутствие этих цистеинов предполагает наличие до 5 S-S связей на
молекулу люциферазы [4], которые, скорее всего, ответственны за экстремальную
стабильность этих люцифераз [19]. Примечательно, что хотя люциферазы Рениллы и
копепода используют один и тот же субстрат и, скорее всего, используют один и
тот же механизм превращения субстрата в свет, эти люциферазы различаются по
размеру и, кроме того, не имеют никакого сходства в своих аминокислотных
последовательностях.

Благодаря высокой стабильности,
малым размерам и сильной биолюминесцентной активности люциферазы копепод быстро
получили известность как репортеры в неразрушающих анализах in vivo [4]. В то
время как применение люцифераз copepod в различных анализах in vivo растет из
года в год, есть только несколько примеров их применения в аналитических
анализах in vitro. Люцифераза Gaussia (GpLuc), генетически слитая с пептидом-акцептором
биотина для биотинилирования in vivo в клетках Escherichia coli, была
протестирована в тесте гибридизации ДНК и показала предел обнаружения 1 Амоль
[6]. Аналогичная чувствительность была достигнута в анализе связывания с
участием Метридий-люциферазы, продуцируемой в кишечной палочке и химически
модифицированной in vitro биотином [18]. GpLuc, конъюгированный с антителом к
интерферону-γ через генетически введенный дополнительный N-концевой тирозин,
был успешно использован для определения INF-γ в сыворотке крови человека [7].
Также был опробован подход, основанный на построении слитых белков. Люцифераза
Gaussia была слита с белком-переносчиком цинка (ZnT8), который является
аутоиммунной мишенью диабета 1 типа. Было продемонстрировано, что аутоантитела
ZnT8 могут быть обнаружены в сыворотках пациентов с более высокой
чувствительностью, чем позволяет коммерчески доступный набор ELISA [8]. Другим
успешным примером является анализ кортизола с использованием люциферазы
Gaussia, слитой с одноцепочечным искусственным антителом, которое оказалось
более чувствительным, чем любой доступный в настоящее время иммуноанализ
кортизола [9].

Учитывая их превосходные
биолюминесцентные и биохимические свойства и несмотря на несколько примеров
применения люцифераз Gaussia и Metridia в качестве слияния белков в анализах in
vivo, количество сообщений об их использовании в качестве меток в связывающих
анализах все еще очень ограничено [4]. Это в основном связано с трудностью
получения белка в клетках E. coli, поскольку правильно сложенные люциферазы
копепод должны содержать пять внутримолекулярных дисульфидных связей [4].
Несмотря на недавно усовершенствованную процедуру получения одной из изоформ
люциферазы Метридия в кишечной палочке [4], эти клетки все еще не выглядят перспективными
для производства белков слияния люциферазы копепода. Тем более что партнером
слияния является одноцепочечное антитело, также содержащее внутримолекулярные
дисульфидные связи. По-видимому, гораздо проще и эффективнее производить такие
синтезированные белки в клетках насекомых, как секретируемые белки, так как это
способствует правильному образованию внутримолекулярных S-S связей.

Цель работы: в рамках
исследования генетической организации и эволюции биолюминесцентной системы
копепод Metridia longa подтвердить наличие многих паралогичных (неаллельных)
генов, обеспечивающих яркое свечение этих рачков. Ранее, на основе анализа кДНК
последовательностей клонированных изоформ для люциферазы Metridia longa,
изолированных при использовании метода функционального скрининга, было
выдвинуто предположение на основе существенных различий в этих кДНК генах, что
существует как минимум 4 группы паралогичных генов для изоформ люциферазы в
геноме этих светящихся копепод. Идентификация и анализ последовательностей интронов,
которые подвержены гораздо большим эволюционным изменениям, поскольку не
подвержены сильному давлению естественного отбора для сохранения
биолюминесцентной функции белка, может дать существенные аргументы для
идентификации групп паралогичных генов и прояснить генетическую основу и пути
эволюции биолюминесцентной функции копепод.

На данном этапе исследований в
задачу работы входило выделение геномной ДНК из замороженных рачков Metridia
longa, подбор оптимальных условий для синтеза геномных вариантов генов,
проведение реакции препаративного синтеза геномного и кДНК-вариантов для как
минимум одной изоформы люциферазы, анализ и сравнение полученных сиквенсов с
целью идентификации интронов и понимания путей эволюции биолюминесцентной  функции копепод.

Заключение:

1. Отсеквенированы cDNA gene as ПЦР-фрагмент концевыми праймерами
on ds cDNA M. longa 10.11.99 и геномный ген из ДНК планктона M. longa ст.7 от
28.10.98 (пара копепод из plankton (снежок замороженных копепод)). Они
совпадают и из их сравнения четко идентифицируются 4 небольших интрона.

2. Идентифицированы по совмещенным пикам 2 вариабельности, которые
четко видны во всех вариантах сиквенсов! Обе в последнем экзоне и они повторяют
уже известные вариабельности из элаймента ранее изолированных клонов.

3. Интересно, что вариабельностей всего 2 позиции в последнем
экзоне. Соотношения пиков в ПЦР-фрагментах почти повторяет частоту
изолированных аллелей!

4. Плюс интроны явно сформировались до дупликации – 2 в одинаковых
местах посередине высококонсервативных повторов. Интроны явно разделяют
функциональные части: первый в начале консервативной части, третий почти
разделяет повторы, второй и четвертый интроны должны быть гомологичны, а
степень их расхождения по теории нейтральной эволюции должна показывать время,
прошедшее с момента  дупликации повторов.

Фрагмент текста работы:

1.
Литературный обзор Копеподы — это мелкие
ракообразные (обычно ≈ 1-2 мм), которые являются основным компонентом морских
зоопланктонных сообществ и играют ключевую роль в океанических пищевых сетях
(Takenaka, Yamaguchi & Shigeri, 2017). Эти животные выступают в качестве
потребителей низшего порядка, важных пастбищ для микропланктона и в качестве
основного источника пищи для многих беспозвоночных и позвоночных хищников,
таких как головоногие моллюски и рыбы (Marine Zooplankton Colloquium 2, 2001;
Takenaka, Yamaguchi & Shigeri, 2017). Во всем мире основная часть
планктонных сообществ (обычно 55-95% особей) часто населена копеподами
(Longhurst, 1985). В пределах зоопланктонных копепод порядок Calanoida может
доминировать (например, в Северном Ледовитом океане) по биомассе (Kosobokova
& Hirche, 2009; Forest et al., 2011). Учитывая исключительную биомассу и
низкое трофическое положение каланоидов, эти крошечные дрифтеры сами по себе
выступают в качестве важного компонента водных пищевых сетей (Takenaka,
Yamaguchi & Shigeri, 2017).