Дипломная работа (ВКР) — бакалавр, специалист на тему Состав бактериальной микрофлоры у женщин страдающих раком лёгкого

Содержание:

Введение. 2

Глава
1. Обзор литературы.. 5

1.1.
Секвенирование нового поколения как метод изучения микробиома человека  5

1.2.
Основные характеристики микробиома дыхательных путей и легких у человека. 9

1.3.
Связь микробиома с раком легкого. 18

Глава
2. Материалы и методы.. 26

2.1.
Краткая характеристика исследованной группы.. 26

2.2.
Сбор и подготовка образцов бактериальной ДНК для NGS секвенирования  35

2.3.
Секвенирование метагеномной ДНК.. 39

2.4.
Биоинформационная и статистическая обработка результатов секвенирования  45

Глава
3. Результаты и обсуждение. 50

3.1.
Представленность основных бактериальных родов в мокроте обследованных женщин. 50

3.2.
Представленность основных бактериальных видов в мокроте обследованных женщин. 53

3.3.
Сопоставление полученных результатов с данными литературы.. 57

Выводы.. 65

Список использованной литературы   68

Введение:

Микробы вездесущи в природе,
населяют почти все мыслимые среды и играют важную роль в жизни человека.
Микробы, хотя в целом невидимы, играют важную роль в функционировании
экосистем, модулируя ключевые экосистемные процессы, такие как рост растений,
круговорот питательных веществ в почве и морской биогеохимический круговорот.
Неисчислимое количество симбиотических, патогенных и комменсальных микробов
колонизировало человеческое тело, коллективно составляя человеческую
микробиоту. Общепризнано, что взаимодействие между человеческим организмом и
кишечной микробиотой оказывает влияние на несколько аспектов здоровья человека.
Функционирующий микробиом является обязательным для организмов-хозяев, так как
он способствует бесперебойному функционированию важных физиологических
процессов. Фактически, организмы-хозяева эволюционировали совместно со своей
микробиотой, причем некоторые комменсалы эволюционировали как патобионты, а
другие-как симбионты. Присутствие определенных комменсалов в кишечнике человека
индуцирует сигналы, которые управляют правильным функционированием и
созреванием иммунной системы. Микробные сообщества приобретают специфическую
структуру в различных хозяевах и физических средах. Следовательно,
идентификация и характеристика микробов, населяющих хозяина, их различных
фенотипов и биохимических путей, посредством которых микробы воздействуют на
своих хозяев, являются основным направлением исследований микробиома хозяина.

Анализ взаимодействий хозяина и
микроба позволяет выявить основные характеристики взаимодействия, включая их
идентификацию, классификацию, прогнозирование профиля и механизмы
взаимодействия. Хотя структура, функция, динамика и взаимодействия этих
микроорганизмов играют существенную роль в метаболизме человека, их
идентификация, количественная оценка и характеристика могут быть
проблематичными. Большинство микробных сообществ чрезвычайно разнообразны, и
большинство отдельных организмов еще не были культивированы. Во-вторых, их
взаимодействие друг с другом и тенденция к формированию сложных сетей
затрудняют прогнозирование их поведения. Установление механистических связей
между кишечной микробиотой и ее функционированием добавляет дополнительную
проблему, особенно в понимании биологии сложных микробных консорциумов.

Классические подходы к микробной
экологии основывались на методах, зависящих от культивирования, для изучения
взаимодействия хозяина и микроба. Хотя эти методы, зависящие от культуры,
позволили получить интересные наборы данных, они также привели к ложному
представлению о микробиоте. Однако в последнее время для качественной и
количественной идентификации микробов развился ряд культурально-независимых
методов, главным образом основанных на ПЦР. Эти методы полностью изменили
представление о человеческом микробиоме и проложили путь к созданию
метагеномики.

Метагеномные исследования
расширяют наши знания о патогенных взаимодействиях с хозяином, выявляя гены,
которые потенциально позволяют микробам влиять на своих хозяев неожиданными
способами. Метагеномные исследования взаимодействий хозяина и микроба могут
предоставить полезную информацию, применимую к широкому кругу дисциплин,
включая наблюдение за патогенами, биотехнологию, взаимодействия хозяина и
микроба, функциональный дисбиоз и эволюционную биологию. Недавние исследования
микробиом хозяина с использованием метагеномных подходов позволили получить
ключевые представления о взаимодействии хозяина и микроба.

Метагеномные исследования не
только позволили исследователям охарактеризовать состав микробных сообществ, но
и дали новую информацию по другим аспектам биологических наук. Например,
метагеномные исследования микробиома человека выявили возможные связи между
микробиомом кишечника и такими заболеваниями человека, как депрессия,
ревматоидный артрит и диабет. Несколько исследований использовали материалы
древних сообществ, чтобы проследить изменения в микробиоме. Эти исследования
провели метагеномные исследования копролитов, зубов и других тканей. При
условии, что нуклеиновые кислоты могут быть извлечены из образца, почти любой
материал из окружающей среды может быть использован в метагеномных анализах.
Одним из крупнейших метагеномных исследований на сегодняшний день является
отбор проб Мирового океана. Метагеномика применяется и в области медицины.

Цель: Исследовать таксономический
состав бактериального микробиома мокроты женщин, страдающих раком легкого

Задачи: 1. Определить представленность
основных бактериальных таксонов на уровне рода и вида в мокроте женщин,
страдающих раком легкого и здоровых доноров.

2. Сопоставить полученные
результаты с данными других исследований состава микробиома дыхательного тракта
пациентов с раком легкого.

Объект исследования: Состав
бактериальной микрофлоры

Предмет исследования: Состав
бактериальной микрофлоры у женщин с раком легкого.

Методы исследования:

Теоретические – изучение научной
и научно-методологической литературы посвященной проблематике исследования

Практические – синтез и анализ
экспериментальных данных, полученных в ходе генетического секвенирования нового
поколения.

Структура работы: работа
напечатана на 74 листах компьютерного набора и включает в себя введение, три
главы, заключение и список использованной литературы.

Заключение:

В течение нескольких десятилетий
метагеномные исследования были сосредоточены на бактериальном микробиоме,
однако клинические и экспериментальные исследования начали подчеркивать роль
грибов в микробиоме человека в целом и в дыхательном микробиоме в частности.
Такое полимикробное сообщество обладает эмерджентными свойствами, которые не
могут быть выведены путем изучения его компонентов по отдельности. В этом
отношении подходы “омикс” будут значительно полезны для выявления и расшифровки
потенциальных грибково–бактериальных взаимодействий, необходимых для
поддержания здорового респираторного микробиома, или, с другой стороны, для
облегчения КРД.

Быстрое развитие технологий NGS
открыло возможности для лучшего определения состава и функций респираторного
микобиома и микробиома в гомеостазе, во время инфекции и в контексте CRD новым
способом. Сейчас крайне важно разработать надежные универсальные
методологические стратегии и проводить крупные многоцентровые исследования.
Несмотря на последние методологические достижения, современные метагеномные
подходы, используемые для изучения микобиомы, все еще имеют определенные
ограничения. Как было предложено, есть множество подводных камней, связанных с
микобиомой, которые нам нужно бросить коллективный вызов. Сначала грибковые
клетки, как известно, трудно взломать и может потребовать химического или
механического лизиса в качестве предварительной экстракцией шаг. Еще один технический
момент в измерении грибов с помощью метода, основанного на ДНК, заключается в
возможности различать ДНК живых микроорганизмов и ДНК мертвых.

Вторая задача заключается в
повышении качества таксономического назначения путем создания точной обновленной
базы данных по грибам. Поскольку внутренние транскрибированные спейсерные (ITS)
области рДНК широко используются для идентификации видов грибов и в последнее
время формализованы в качестве универсальных ДНК-штрих-маркеров для грибов,
было проведено несколько проектов по разработке грибных баз данных, таких как
ITSDB или UNITE for QIIME released3 или ISHAM ITS Database4. Позже ЕГО база
данных была недавно сгенерирована из контролируемых качеством ЕГО
последовательностей, которые представляют фактическую вариацию
последовательности, обнаруженную у каждого вида. Учитывая, что грибы
представляют собой крупнейшее семейство микроорганизмов с несколькими
названиями, еще одной задачей является предотвращение ненужного номенклатурного
потока, как это недавно было предложено. В этом контексте базы данных ISHAM ITS
или UNITE представляют собой прекрасную возможность создать точную базу данных
с согласованной номенклатурой. Необходимы также дальнейшие достижения в области
генерации и анализа данных, чтобы свести к минимуму ошибки и неверные
интерпретации, сделать перекрестные исследования и многоцентровые исследования
более выполнимыми и, наконец, связать стенд и клинику.

Чтобы понять биологическую
функцию респираторного микобиома в воспалительных реакциях легких хозяина, его
роль в прогрессировании КРД, его роль в локальных межцарствных микробных
взаимодействиях, а также в перекрестном разговоре между кишечным и легочным
микробиомами, необходимо провести будущие крупномасштабные поперечные и
лонгитюдные исследования, чтобы ответить на эти поставленные вопросы. По
аналогии с сигнатурами микробиоты, недавно предложенными для оценки реакции на
диетические вмешательства у людей с ожирением и для прогнозирования будущих
обострений бронхоэктазов, определение как специфических микобиот, так и
респираторных сигнатур микробиоты может быть полезно для профилактического или
терапевтического лечения при КРР. Эти микробиомные и микобиомные сигнатуры
могут также служить специфическими биомаркерами, предшествующими клиническим
проявлениям болезни (КРБ), которые должны быть более чувствительными, чем
обычные методы культивирования. Затем они могут стать индикатором
своевременного клинического вмешательства и успешного ведения болезни.

Цель состоит в том, чтобы
установить как микобиом, так и микробиом в дыхательных путях с течением времени
во время респираторной суперинфекции или острого легочного обострения, чтобы
обеспечить ключевые элементы (сигнатуры, дисбактериоз) для ранней диагностики и
соответствующей профилактической терапии вторичных инфекций. Лонгитюдные
исследования помогут проанализировать грибково–бактериальные взаимодействия
одновременно во время прогрессирования КРД и исхода терапии. Все эти
дополнительные исследования необходимы для выработки гипотез, которые будут исследоваться
на моделях in vitro и животных.

Фрагмент текста работы:

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Секвенирование нового
поколения как метод изучения микробиома человека Микробы выполняют важные функции,
которые приносят огромную пользу здоровью планеты и ее обитателей. Микробы
помогают регулировать, регулировать и поддерживать атмосферу Земли,
поддерживать рост растений и помогают для подавления болезней растений,
способствует здоровью человека, расщепление вредных химических веществ,
присутствующих в загрязненной среде, поддержка устойчивого сельского хозяйства,
модулируют парниковых газов, являются основными составляющими различных
биогеохимических циклов и в значительной степени способствовать экологических
процессов, включая изменение климата. В дополнение к восстановлению
загрязненной окружающей среды и модуляции атмосферы, совместная деятельность
этих невидимых микробных сообществ формирует лицо биосферы и представляет собой
неиспользованные резервуары новых биомолекул, включая фармакологические
препараты и промышленные ферменты. Микробы, сосуществующие в человеческом теле,
предлагают множество преимуществ, модулируя фундаментальные метаболические
процессы, иммунитет и передачу сигналов. Все больше данных свидетельствует о
том, что существует значительная связь между микробиомом кишечника человека и
развитием человеческих заболеваний.

Раньше было трудно изучать
микробы в их естественной среде, и поэтому микробиологи ограничивались
изучением отдельных видов в лаборатории. Такой подход, однако, ограничивает
возможности получения данных о микробных сообществах, населяющих разнообразные
экосистемы. Метагеномика помогла устранить это ограничение и значительно расширила
наше понимание целых микробных сообществ, тем самым значительно продвинув наши
знания о микробной экологии и микробиологии в целом. Метагеномика,
поддерживаемая секвенированием следующего поколения (NGS), буквально сняла
ограничения и границы, связанные с классическими культуральными подходами.
Технология NGS позволила всесторонне изучить различные микробиомы в их родной
среде, включая океанический микробиом, микробиом кожи человека, микробиом
человека и микробиом моря Сарагосы. Некоторые из новых открытий, сделанных
метагеномикой, включают идентификацию эндосимбиотических бактериальных типов,
процессы нитрификации, болезнетворные микроорганизмы человека, связанные с
эпидемиями, бактерии и вирусы, связанные с воспалительными заболеваниями
кишечника, и идентификация комменсальных кишечных бактерий.

Человеческое тело служит хозяином
для сетевого сообщества микроорганизмов (микробиома), которые превосходят по
численности собственные клетки организма. Исследования микробиома человека
представляют огромный интерес в последние несколько лет из-за тесной связи
микробиома со здоровьем человека. Микробиом человека “наш второй геном” тесно
взаимодействовал с человеком на протяжении миллионов лет и играет решающую роль
в здоровье человека. Расшифровка состава и функций микробиома человека может
дать более глубокое понимание его структурных и функциональных свойств. В
будущем наше понимание микробиома человека и применение метагеномного анализа
значительно улучшат наше понимание здоровья и болезней человека у конкретных
людей. Считается, что изучение микробиома и метагенома человека представляет
собой рубеж в генетике человека.

Большинство исследований
микробиома человека сосредоточено на микробах, колонизирующих пищеварительную
систему человека, поскольку считается, что эти микроорганизмы влияют на
здоровье человека различными способами. Микробиом пищеварительной системы
чрезвычайно разнообразен, с существенными вариациями его составляющих у разных
людей. Показано, что модуляция микробиома внешними факторами, такими как
трансплантация кала и диетическое вмешательство, является потенциальным
терапевтическим подходом к решению ряда проблем, связанных со здоровьем.
Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) содержит огромное разнообразие микробов,
включающих в себя внутренние сети взаимодействий как микроб-микроб, так и
микроб-хозяин. Было обнаружено, что микробные гильдии (виды, эксплуатирующие
одни и те же ресурсы) обладают интересной особенностью, которая может быть
использована для понимания процессов, происходящих как на уровне отдельной
клетки, так и на уровне сообщества. Микробы в нормальных физиологических
условиях являются комменсалами и опосредуют пищеварение, укрепляют иммунную
систему и подавляют или предотвращают проникновение патогенов в организм.
Взаимосвязь между человеческим микробиомом и здоровьем человека остается в
значительной степени неизвестным и неизведанным, однако ряд эпидемиологических
исследований установлено, что общее снижение разнообразия микробиоты
пищеварительного тракта связано с такими заболеваниями, как экзема, астме и
воспалительных заболеваниях, сахарный диабет и ожирение, аллергии,
пищеварительных расстройств, таких как IBD (воспалительное заболевание
кишечника) и СРК (синдром раздраженного кишечника). Дисбиоз (микробный
дисбаланс) также был связан с генезом и эволюцией множества других заболеваний,
включая синдром хронической усталости, рак, колит, бактериальный вагиноз,
тревогу и депрессию. Несколько недавних исследований подчеркнули важную роль,
которую микробиом кишечника играет в модуляции различных иммунных реакций,
включая иммунную толерантность, через модуляцию Treg (T-регуляторных) клеток.
Исследования, проведенные Geuking et al, показали, что короткоцепочечные жирные
кислоты (SCFA) могут способствовать развитию Treg-клеток в кишечнике. Кишечные
микробы способствуют расщеплению сложных углеводов и способствуют утилизации
полисахаридов. Другими примерами поддерживающих здоровье функций кишечного
микробиома являются защита от болезней с помощью иммунной модуляции,
трансплантация фекального микробиома, метаболизм, токсичность ксенобиотиков и
фармакокинетика.