Дипломная работа (ВКР) — бакалавр, специалист на тему Морфологическое состояние поджелудочной железы крыс под влиянием экзогенных негативных факторов (наночастиц диоксида титана)

Содержание:

ВВЕДЕНИЕ. 3

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 9

1.1 Строение поджелудочной железы крыс. 9

1.2 Морфологическая система поджелудочной железы крыс. 13

1.3 Общая характеристика наночастиц. 20

1.3.1 Типы наночастиц и их применение в биомедицине. 20

1.3.2 Наночастицы диоксида титана. 24

1.4 Токсические свойства наночастиц. 31

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.. 35

2.1 Объект исследования. 35

2.2 Материал исследования. 35

2.3 Схема и методы исследования. 35

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ НЕГАТИВНЫХ ЭКЗОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА
МОРФОЛОГИЮ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС.. 39

3.1 Поджелудочная железа крыс при воздействии наночастиц
диоксида титана  39

3.2 Морфологические особенности поджелудочной железы на
фоне введения наночастиц диоксида титана. 41

ВЫВОДЫ.. 49

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ   50

Введение:

Актуальность
темы. Спектр потенциально токсичных химических веществ,
используемых человеком в повседневной жизни, постоянно растет, в связи с чем
существует острая необходимость в исследовании их негативного эффекта на
различные органы и ткани человека.

В
последнее время пристальное внимание привлечено к относительно новым
ультрадисперсным формам веществ, полученным с использованием нанотехнологий, к
числу которых относят наночастицы (НЧ). В наноразмерном состоянии (<100 нм)
любые вещества приобретают новые химические, физические и биологические
свойства, существенно отличающиеся от их свойств в макрообъемном состоянии и обусловливающие
широкое использование НЧ в различных сферах человеческой деятельности.

Вместе
с тем накоплены данные, что их небольшие размеры и очень высокая удельная
поверхность (в расчете на единицу массы), а также значительная реакционная
способность позволяет им при попадании в организм беспрепятственно преодолевать
биологические барьеры, увеличивать продукцию активных форм кислорода (АФК), что
приводит к повреждению внутриклеточных структур.

Среди
применяемых в настоящее время наноматериалов наиболее широко используются НЧ
диоксида титана (TiO2) (Piccinno F. et al., 2012; Ma Y., 2014). Они имеют ряд
потребительских достоинств, связанных с хорошей фотокаталитической активностью,
высокой химической и термической стабильностью и относительно невысокой
стоимостью.

Традиционно
НЧ TiO2 рассматривались как плохо растворимые, химически инертные частицы, обладающие
низкой токсичностью, они даже использовались в качестве отрицательного контроля
при сравнении соединений в ряде токсикологических исследований. Однако быстрый
рост числа публикаций о негативном воздействии НЧ TiO2 на различные органы и
ткани свидетельствует о высоком интересе исследователей к их биологической
безопасности.

Неблагоприятное
влияние НЧ TiO2 на клетки и ткани человека возможно, как в производственных условиях,
когда человек не имеет возможности избежать такого контакта, так и в результате
непреднамеренного употребления, связанного с их включением в состав продовольственных,
промышленных и фармакологических товаров.

Следует
подчеркнуть, что несмотря на то, что экологи и токсикологи рассматривают НЧ как
новые потенциально опасные для биологических структур материалы исследования по
безопасности НЧ TiO2 существенно отстают от масштабов их использования. Так,
Британская неправительственная организация Soil Association, занимающаяся
сертификацией органических продуктов, отказалась сертифицировать продукты,
содержащие искусственно созданные НЧ с размером менее 125 нм, считая их
потенциально опасными для здоровья.

В
Европе, к примеру, во Франции, два министерства – экологии и экономики
подписали совместное постановление о том, что с 1 января 2020 года в этой
стране вводится официальный запрет на использование пищевой добавки Е171 (TiO2)
при производстве продуктов питания. В России использование Е171, в составе
которой до 36% частиц имеют размер менее чем 100 нм, никак не регламентировано
санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами по использованию пищевых
добавок. Таким образом, максимальная концентрация TiO2 устанавливается
технологическими инструкциями, то есть самим производителем.

Существенным
фактором, который следует учитывать при изучении разнообразных эффектов НЧ
TiO2, является их способность накапливаться в организме, что может привести к
отсроченным во времени морфофункциональным проявлениям воздействия этих
соединений.

Кроме
того, нарушения структуры и функции любого органа, которые обнаруживаются после
введения НЧ, могут быть не только следствием прямого их воздействия на
различные клетки, но и результатом повреждения других органов и систем —
суммарный эффект. Известно, что наибольшую опасность для здоровья человека
представляет нарушение работы регуляторных систем, к которым относятся нервная,
иммунная, эндокринная и ряд других, в частности, репродуктивная.

Учитывая
вышеупомянутую негативную тенденцию, актуальность детального исследования
влияния наночастиц диоксида титана на морфофункциональное состояние одного из
ключевых звеньев пищеварительной системы и метаболических процессов –
поджелудочной железы, не вызывает сомнений.

Степень
разработанности темы исследования. Эффекты влияния НЧ TiO2, в том числе и
токсические, молекулярные механизмы их воздействия на различные ткани организма
в последние годы активно изучаются. На различных моделях показано, что
воздействие НЧ TiO2 приводит к повышенной генерации АФК многими клетками
организма, что является одним из основных повреждающих факторов для большинства
из них.

Выявлено,
что НЧ TiO2 вызывают усиление ПОЛ, активацию ряда каспаз, в конечном итоге
повреждение ДНК и, как следствие этого, последующую апоптотическую гибель
клеток.

В
качестве определяющего фактора неблагоприятных последствий воздействия НЧ TiO2
в литературе выделяют размер и кристаллическую фазу. Две аллотропные формы НЧ –
анатаз и рутил – имеют разные поверхностные свойства и реакционную способность.
В зависимости от кристаллической структуры токсические свойства НЧ TiO2 могут
варьировать.

На
сегодняшний день в литературе существует противоречивая информация относительно
негативных эффектов разных кристаллических форм НЧ TiO2. Показано, что
анатазная структура НЧ TiO2 в 100 раз более токсична, чем его рутильная форма.
Обе фазы – анатаз и рутил – широко используются при производстве солнцезащитных
кремов, красок, пластмасс, бумаги и др. Однако последняя, ввиду более высокой
поглощающей способности, твердости и химической стойкости, используется гораздо
чаще. Вместе с тем в последние годы появились данные о сходных по силе и
направленности эффектах этих форм НЧ TiO2, в связи с чем, возникает
необходимость изучения последствий воздействия НЧ TiO2 рутильной модификации на
клетки и ткани организма.

Кроме
того, в большинстве работ авторы не всегда уточняют кристаллическую фазу НЧ,
что затрудняет интерпретацию данных и указывает на дефицит информации
относительно неблагоприятных эффектов различных форм НЧ TiO2.

Таким
образом, несмотря на значительное число публикаций, посвященных исследованию
влияния НЧ TiO2, систематизированные данные о морфофункциональных изменениях
нервной, иммунной, репродуктивной систем в литературе отсутствуют, что не
позволяет в полной мере оценить эффект их воздействия на организм человека.

Объект
исследования. Механизмы патогенного воздействия наночастиц
диоксида титана.

Предмет
исследования. Морфофункциональные показатели
поджелудочной железы крыс.

Цель
исследования: провести детальный анализ структурно-функциональной
изменчивости организации поджелудочной железы крыс под влиянием перорального введения
наночастиц диоксида титана в дозе 10 мг/кг.

Задачи
исследования:

1.
Провести теоретический анализ изучаемой проблемы;

2.
Разработать схему проведения эксперимента в лабораторных условиях;

3.
Провести анализ влияния НЧ диоксида титана на ПЖ крыс;

4.
Проанализировать особенности морфологических изменений поджелудочной железы крыс
на фоне введения наночастиц диоксида титана.

Научная
новизна исследования заключается в том, что впервые охарактеризованы
морфофункциональные изменения в поджелудочной железе при воздействии наночастиц
TiO2, вводимых пероральным путем в организм крыс.

Практическая
значимость исследования. Получены новые данные фундаментального
характера, раскрывающие морфологические и физиологические аспекты влияния НЧ
TiO2 на различные органы и ткани, которые приближают нас к пониманию механизмов
их токсического воздействия на организм в целом. Полученные данные представляют
практический интерес, поскольку традиционно считается, что нанодисперный TiO2 в
рутильной модификации гораздо менее токсичен, чем его анатазная кристаллическая
форма.

Поскольку
в настоящее время высока вероятность непреднамеренного воздействия на человека
различных наноматериалов, в том числе и НЧ TiO2, ввиду их широкомасштабного
использования в различных сферах жизнедеятельности, появилась необходимость
максимально уменьшить риски отрицательных последствий таких контактов.

Однако
на сегодняшний день, к сожалению, отсутствуют адекватные методы диагностики и
лечения последствий неблагоприятного воздействия НЧ на организм человека. В
связи с этим полученные нами данные позволяют разработать новые подходы для
устранения негативных эффектов наноматериалов на клетки организма и меры их профилактики.

Выявленные
морфофункциональные изменения в ключевых, в том числе и регуляторных, системах
показали, что при длительном воздействии НЧ TiO2 даже максимальные допустимые
уровни его содержания в продуктах питания, косметических средствах с учетом их
способности аккумулироваться в организме не всегда являются безопасными для
человека. Полученные данные о влиянии длительного воздействия рутильной формы
нанодисперсного TiO2 на морфологию и функциональность ПЖ могут стать основой
для дальнейших исследований по установлению безопасных уровней его содержания в
продовольственных товарах, лекарственных препаратах, средствах гигиены и т.д., так
как их использование не регламентировано санитарно-эпидемиологическими правилами
и нормативами, а концентрация устанавливается технологическими инструкциями, то
есть самим производителем.

Методология
и методы исследования. Методология заключалась в системном
подходе и комплексном анализе результатов морфологического исследования и их
сопоставлении с данными иммуногистохимического, морфометрического,
биохимического исследований и микроскопии. Проведен критический анализ
отечественных и зарубежных научных трудов в области нанотоксикологии, которые
явились теоретической и методологической базой диссертационного исследования. В
работе был использован комплекс методов: гистологические морфометрические, электронномикроскопические,
биохимические тесты, а также статистический анализ, позволившие детально
изучить не только структурные изменения тканей и адекватно идентифицировать
клетки, но и охарактеризовать их функциональное состояние.

Структура
ВКР:
Исследование структурно состоит из введения, двух глав, теоретического и
практического характера, выводов и списка литературы. Дипломная работа изложена
на 57 листах компьютерного текста, иллюстрирована 3 таблицами и 23 рисунками.
Список литературы содержит 61 наименований, из которых 25 – авторства
зарубежных исследователей.

Заключение:

1. Поджелудочная
железа как орган начинает функционировать во внутриутробном периоде, но ее морфофунциональное
становление продолжается длительное время после рождения в условиях изменения
типа питания. От правильного развития и формирования структурных компонентов
поджелудочной железы зависит становление пищеварительной системы и различных
видов обмена в целом.

2.
Известно, что на поджелудочную железу могут воздействовать различные факторы, в
том числе наночастицы различных металлов, которые могут привести к нарушениям
ее морфогенеза. Поэтому в эксперименте была использована модель воздействия НЧ
диоксида титана.

3.
Комплексным анатомо-экспериментальным исследованием с использованием
анатомических, гистологических, гистохимических, лектингистохимических методов
решена актуальная научная задача нормальной анатомии, которая заключается в
установлении особенностей строения и реактивности поджелудочной железы крыс в
норме и после перорального введения НЧ диоксида титана.

4.
Структура поджелудочной железы крыс соответствует норме. Хорошо различимы
экзокринная и эндокринная часть железы. Островки эндокринной части были не
правильной формы за счет воздействия диоксида титана.

5.
Изучение морфологических особенностей контрольной групп крыс после получения
перорального введения диоксида титана в дозе 10 мг/кг, отмечалось полнокровие
кровеносных сосудов, отек соединительной ткани.

6.
Результат исследования демонстрирует, что пролиферация в ткани поджелудочной
железы происходит как в норме, так и при экспериментальном введении наночастиц
диоксида титана. Звездчатые клетки поджелудочной железы участвуют в ее
регенерации при введении НЧ. Пролиферативнцю активность самих звездчатых клеток
поджелудочной железы выявить не удалость. Так же пролиферация происходит в
клетках протокового эпителия и клетках сосудов.

Фрагмент текста работы:

1.2 Морфологическая система поджелудочной
железы крыс

Внутреннее
строение поджелудочной железы крыс и человека имеет единый план структурной
организации, несмотря на то, что внешняя форма органа, размеры, а также
отношения к брюшине не соответствуют описанной в человека. Поэтому единый план
строения поджелудочной железы крыс и человека позволяет ее использовать в
качестве адекватного биологического объекта при изучении действия различных
факторов в эксперименте [23, 28].

В
посленатальном периоде железа крыс представлена плоским, диффузным органом с
непостоянными очертаниями, состоящим из отдельных маленьких гроздевидных долек,
связанных рыхлой соединительной тканью в одно древовидное разветвленное
образование [17].

Расположена
в брыжейке, длина поджелудочной железы крыс составляет 3-5 см, ширина 0,3 см,
масса 0,470 г. Поджелудочная железа крыс, как и человека, имеет три части –
головка (дуоденальная часть), тело (пилорическая часть), и хвост
(желудочно-селезеночная часть). Поджелудочная железа крыс отличается весом,
большей рыхлостью, изогнутостью и разветвленностью. Разделяют правую и левую
доли, левая прилегает к двенадцатиперстной кишке, правая позади желудка. Через
поджелудочную железу частично проходит желчный проток. Большая в эмбриогенезе
печень крыс сводит другие органы брюшной полости к срединной линии таким
образом, что длинная поджелудочная железа образует между желудком и
двенадцатиперстной кишкой угол, открытый вентрокаудально.

Эмбриональный
угол сохраняется в том или ином виде у человека и у крыс. Встречаются два
крайних варианта строения и топографии поджелудочной железы крыс: более частый
– молотоподобная поджелудочная железа, более близка к строению железы человека,
с минимальными размерами у крыс и локальными деформациями головки; более редкая
– поджелудочная железа в виде трилистника, когда от головки отходят три
пластинки (желудочно-селезеночная, межободочная, и тощекишечная) [33].

Экзокринная
часть поджелудочной железы Шуров представлена ацинусами, которые состоят из
ациноцитов, центроацинозных клеток, вставочных протоков и капилляров с
эндотелием соматического типа. Панкреатические островки характеризуются
определенными размерами и структурой, межклеточным взаимодействием,
аутокринной, паракринной и нейрогуморальной регуляцией [10, 20].

Типичный
островок состоит из 4-х основных типов клеток: из β-клеток, содержащих инсулин,
А-клеток, которые содержат глюкагон; Д — клетки, содержащие соматостатин, и
РР-клеток, которые содержат панкреатический полипептид. Кровеносные капилляры
подходят к центру островка, имеют фенестрированный тип эндотелия; с помощью
синусоидных фенестрированных капилляров кровообращение осуществляется к
периферии.

Межклеточное
взаимодействие опосредуется специфическими мембранными структурами-щелевыми
контактами. Кроме классических эндокриноцитов, в панкреатических островках
присутствуют клетки, синтезирующие анилин.

Анилин
– это пептидный гормон, который состоит из 37-ми аминокислотных остатков,
синтезируется, упаковывается в секреторные гранулы и декретируется вместе с
инсулином β-клетками в ответ на повышение уровня глюкозы в крови. Наиболее
изученными физиологическими эффектами анилина является угнетение чувства
голода, опосредованно действуя на гипоталамические и стволовые структуры,
сокращение опорожнения желудка и удлинение периода абсорбции глюкозы, таким
образом, регулируя пищеварительное поведение. У животных 1-го месяца жизни
процентное содержание α-клеток и β-клеток практически одинаковый. Период
половой зрелости и начало старения животных характеризуется существенным
превышением доли β-эндокриноцитов, а у старых 24-х месячных животных, вновь
отмечается рост процента А — клеток в островках [20].

Нервный
аппарат представлен миелиновыми и без миелиновыми нервными волокнами. Таким
образом, установлено, что внешняя форма органа, а также отношение к брюшине не
совпадают с описанной поджелудочной железой человека [22]. Однако внутреннее
строение поджелудочной железы крыс и человека имеет единый план структурной
организации.

Реактивность
поджелудочной железы, то есть ее морфофункциональное состояние, изучались при
различных воздействиях, которые проводились в эксперименте.

Гипоплазия
поджелудочной железы обусловлена ​​преимущественно недоразвитием экзокринного
компонента и замедленным дифференцированием ацинозных клеток, а также
уменьшением удельной плотности островковой ткани. Достоверно зависимыми от
влияния различных факторов появилась масса железы и удельная плотность проточной
части органа [22, 27].

Исследовано
влияние изменения температурного режима на структуру поджелудочной железы.
Кратковременное понижение температуры не вызывало существенных изменений в
поджелудочной железе, отслеживалось лишь задержания метаболических процессов. В
экзокринной части наблюдаются изменения ультраструктуры ацинарных клеток.

В
первую очередь оказываются расширение цистерн гранулярной эндоплазматической
сети, с частичной ее дегрануляцией; частичная редукция комплекса Гольджи. При
гипертермии в экзокринной части поджелудочной железы часто возможно встретить
двуядерные клетки, встречаются также пикнотичные ядра, многие клетки находятся
в состоянии митоза. Данное влияние характеризуется значительным чередованием
светлых и темных ацинарных клеток.

В
значительной степени выявляется распространение гранулярной эндоплазматической
сетки с дегрануляцией, распространением уплощенных цистерн комплекса Гольджи с
уменьшением количества мелких везикул и вакуолий; вблизи панкреатических
протоков в ацинусах наблюдается везикуляция цитоплазмы [30].

Ряд
работ посвящен изучению морфофункциональных изменений в поджелудочной железе
при гипоксии и гипероксигенации. Наблюдаются изменения как в экзо, так и в
эндокринной части поджелудочной железы.

Особенно
изменения выражены в кровеносных сосудах микроциркуляторного русла. В ранние
сроки действия гипоксии наблюдаются дистрофические изменения, приводящие ее к
гипофункции железы, и нарушения белкового обмена.

Об
этом свидетельствуют особенности ультраструктуры: вакуолизация с инвагинацией
гранулярного эндоплазматического ретикулума с уменьшением количества рибосом на
его мембранах и в свободном состоянии в цитоплазме, в некоторых участках с
полной дегрануляцией мембран, набухание митохондрий с просветлением матрикса и
дискомпексацией кристен, редукция комплекса Гольджи, распространение перинуклеарного
пространства и ядерных пор, отсутствие незрелых форм секреторных гранул.

В
ацинарных клетках наблюдаются как репаративные явления, так и изменения,
которые свидетельствуют о начале компенсаторной гиперфункции железистого
аппарата. Отмечается распространение цистерн ГЭС с большим количеством рибосом
на мембранах и в свободном состоянии в цитоплазме, гипертрофия и гиперплазия
комплекса Гольджи, появление большего количества гиперосмированых митохондрий,
зрелых и незрелых форм секреторных гранул.

В
цитоплазме ацинарных клеток, вблизи выводных протоков обнаружены тонкие
фибриллярные структуры. В ацинарных клетках наблюдается расширение цистерн
гранулярной эндоплазматической сетки с дегрануляцией и одновременно с появлением
свободно лежащих моно- и полиизменениями компонентов пластического комплекса
Гольджи. Митохондрии резко набухают: у одних из них наблюдается деструкция
крист, в других-лизис и гомогенизация крист [30].